SDS-PAGE實驗試劑配制和操作方法

試劑：

1. 5x樣品緩沖液(10ml):0.6ml 1mol/l的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巰基乙醇，1ml 1%溴酚藍，0.9ml蒸餾水。可在4℃保存數周，或在-20℃保存數月。

2. 凝膠貯液：在通風櫥中，稱取丙烯酰胺30g，甲叉雙丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。過濾后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1個月。

3. pH8.9分離膠緩沖液： Tris 36.3g ，加1mol/l HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，調pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。

4. pH6.7濃縮膠緩沖液： Tris 5.98g ，加1mol/l HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，調pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。

5. TEMED(四乙基乙二胺)原液。

6. 10%過硫酸銨(用重蒸水新鮮配制)。

7. pH8.3 Tris-甘氨酸電極緩沖液：稱取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸餾水約900ml，調pH8.3后，用蒸餾水定容至1000ml。置4℃保存，臨用前稀釋10倍。

8. 考馬斯亮藍G250染色液：稱100mg考馬斯亮藍G250，溶于200ml蒸餾水中，慢慢加入7.5ml 70%的過氯酸，zui后補足水到250ml，攪拌1小時，小孔濾紙過濾。

SDS-PAGE 凝膠的有效分離范圍

丙烯酰胺濃度(%) 15 12.5 10 7.5 5.0

線性分離范圍 15-435kDa 15-60kDa 18-75kDa 30-120 kDa 60-212 kDa

器材

電泳儀 ，電泳槽，水浴鍋，搖床。

樣品制備

將蛋白質樣品與5X樣品緩沖液(20μl+5μl)在一個eppendorf 管中混合。放入100℃加熱5-10min，離心，取上清點樣。

電泳

1. 將玻璃板、樣品梳、Spacer用洗滌劑洗凈，用ddH2O沖洗數次，再用乙醇擦拭，晾干;

2. 將兩塊洗凈的玻璃板之間加入Spacer，裝好玻璃板;

3. 按如下體積配制10%分離膠8.0 ml，混勻;

ddH2O 3.0 ml

1.0 mol/l Tris-HCl pH=8.8 2.1 ml

30% Acr-Bis 2.8 ml

10% SDS 80 μl

10%AP 56 μl

TEMED 6 μl

4. 向玻璃板間灌制分離膠，立即覆一層重蒸水，大約20 min后膠即可聚合;

5. 按如下體積配制6%濃縮膠3.0 ml，混勻;ddH2O 1.0 mol/l Tris-HClpH=6.8 30%

將上層重蒸水傾去Acr-Bis

2.0 ml 400 μl 600 μl

10% SDS 10% AP TEMED

36μl 24μl 4μl

6. 濾紙吸干，灌制濃縮膠，插入樣品梳;

7. 裝好電泳系統，加入電極緩沖液，上樣20 μl;