詳述 PCR 技術的基本原理、實驗步驟及應用

　　一、實驗目的

　　1.掌握聚合酶鏈式反應的原理。

　　2. 掌握移液槍和 PCR 儀的基本操作技術。

　　二、實驗原理

　　PCR 可以被認為是與發(fā)生在細胞內(nèi)的 DNA 復制過程相似的技術，其結(jié)果都是以原來的 DNA 為模板產(chǎn)生新的互補 DNA 片段。細胞中 DNA 的復制是一個非常復雜的過程。參與復制的有多種因素。PCR 是在試管中進行的 DNA 復制反應，基本原理與細胞內(nèi) DNA 復制相似，但反應體系相對較簡單。

　　PCR 由變性 -- 退火 -- 延伸三個基本反應步驟構(gòu)成：①模板 DNA 的變性：模板 DNA 經(jīng)加熱至 94℃左右一定時間后，使模板 DNA 雙鏈或經(jīng) PCR 擴增形成的雙鏈 DNA 解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應做準備;

　　②模板 DNA 與引物的退火 (復性)：模板 DNA 經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至 55℃左右，引物與模板 DNA 單鏈的互補序列配對結(jié)合;

　　③引物的延伸：DNA 模板 -- 引物結(jié)合物在 Taq 酶的作用下，以 dNTP 為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板 DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

　　重復循環(huán)變性 -- 退火 -- 延伸三過程，就可獲得更多的 “半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需 2～4 分鐘， 2～3 小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

　　三、實驗試劑與器材

　　模板 DNA、2.5mmol/L dNTP

　　Taq DNA 聚合酶(5U/μL)、SSR 引物

　　10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2O

　　PCR 儀、移液槍、PCR 板

　　四、實驗步驟

　　1、配制 20μL 反應體系，在 PCR 板中依次加入下列溶液：

　　模板 DNA 2μL

　　引物 1 1μL

　　引物 2 1μL

　　dNTP 1.5μL

　　MgCl2 2μL

　　10×buffer 2μL

　　ddH2O 10μL

　　Taq 酶 0.5

　　2、設置 PCR 反應程序。

　　3、上樣，啟動反應程序。

　　4、擴增產(chǎn)物的電泳檢測。

　　產(chǎn)品優(yōu)勢：

　　本生生物供應實驗室耗材,PCR 耗材品種全，可替代儀器原廠耗材，性價比高，質(zhì)量穩(wěn)定，對用戶可以節(jié)省實驗成本。

       注：以上僅供參考！

　　適應客戶：

　　醫(yī)院檢驗科 PCR 實驗室，中心實驗室，肝病中心;第三方檢測機構(gòu)，科研院所，大專院校，制藥廠，試劑生產(chǎn)廠家，疾控中心，檢驗檢疫。