你知道如何正確操作發酵罐嗎？

一、操作前：準備與滅菌（核心前提 —— 杜絕雜菌污染）

1. 設備與物料檢查

• 發酵罐本體：檢查罐壁、攪拌槳（或氣升式導流筒）、密封件（如機械密封、O 型圈）是否完好，無破損、變形或滲漏；確認溫度傳感器、pH 電極、溶氧電極（DO 電極）、壓力傳感器等探頭安裝牢固，無松動或污染。

• 管路系統：檢查進料管（培養基、補料）、進氣 / 排氣閥（無菌空氣、尾氣處理）、取樣管、放料管的閥門是否靈活，管路無堵塞、老化；確認蒸汽管路（用于滅菌）壓力正常（通常 0.3-0.5MPa），無泄漏。

• 輔助系統：檢查無菌空氣系統（空壓機、過濾器、除濕裝置）是否正常，空氣過濾器（前置、除菌級）是否在有效期內；確認溫控系統（加熱 / 冷卻夾套、循環水）、攪拌電機、蠕動泵（補料 / 消泡劑）運行正常。

• 物料準備：培養基需按配方精準配制（如碳源、氮源、微量元素、pH 調節劑），并經預過濾（如 0.22μm 濾膜，去除粗顆粒）；菌種需提前活化（如斜面培養→種子液擴大培養），確保活性與純度。

2. 罐體與管路滅菌（核心步驟 —— 濕熱滅菌為主）

1. 加液與排氣：將配制好的培養基（體積不超過罐體總容積的 70%，避免發酵時溢出）加入發酵罐，關閉所有閥門，打開排氣閥和蒸汽進口閥，緩慢通入蒸汽，排出罐內和管路中的冷空氣

2. 升溫與保壓：當排氣閥排出純蒸汽（無冷凝水、蒸汽連續均勻）時，關閉排氣閥，繼續通蒸汽，使罐內壓力升至0.1-0.12MPa（對應溫度 121℃），同時開啟攪拌（低速，100-200rpm，確保培養基受熱均勻）。

3. 恒溫滅菌：維持 121℃、0.1MPa 壓力，根據培養基成分和罐體體積保溫滅菌，常規時間為20-30 分鐘（含管路滅菌，需打開各支管閥門，讓蒸汽流經所有管路）；若培養基含熱敏性成分（如維生素、酶），可采用 “低溫長時” 滅菌（如 115℃、0.06MPa，30-40 分鐘）。

4. 降溫與保壓：滅菌結束后，關閉蒸汽閥，打開排氣閥緩慢泄壓（泄壓速度≤0.01MPa / 分鐘，避免壓力驟降導致培養基暴沸），同時開啟冷卻系統（如夾套通冷卻水），將培養基溫度降至發酵設定溫度（如細菌 30-37℃、酵母菌 28-30℃、真菌 25-30℃）。

5. 無菌保護：降溫過程中，需向罐內通入無菌空氣（維持罐內微正壓，0.02-0.05MPa，防止外界雜菌進入），直至溫度穩定在設定值。

3. 探頭與附件滅菌

• 電極滅菌：溫度傳感器、pH 電極、DO 電極需隨罐體一同滅菌（耐高溫型號）；若為不耐高溫電極（如部分 pH 電極），需在滅菌后采用 “無菌操作” 插入罐體，插入前需用 75% 乙醇擦拭消毒，再用無菌生理鹽水沖洗。

• 取樣管 / 補料管滅菌：滅菌后需關閉取樣閥、補料閥，保持管路內無菌狀態，使用前需先排放少量管路內的冷凝水或殘留蒸汽，再進行取樣或補料。

二、操作中：發酵過程控制（核心環節 —— 參數精準調控）

1. 無菌接種（杜絕污染的關鍵節點）

1. 接種前，用 75% 乙醇擦拭發酵罐接種口（或接種塞），并開啟接種口周圍的紫外燈消毒 30 分鐘（消毒后關閉紫外燈，通風 15 分鐘）。

2. 打開接種口，快速將活化好的種子液（接種量通常為 5%-10%，根據菌種生長速度調整）倒入罐內，或通過無菌移液管 / 蠕動泵注入，全程動作迅速，避免空氣長時間接觸。

3. 接種后，關閉接種口，確保密封，維持罐內微正壓（0.02-0.05MPa），開啟攪拌（按設定轉速，如 200-500rpm，根據菌種需氧性調整）和無菌空氣供應（通氣量通常為 0.5-2vvm，即每小時通入的空氣體積為罐體體積的 0.5-2 倍）。

2. 關鍵參數監控與調節

3. 取樣與過程分析

• 無菌取樣：取樣前，用 75% 乙醇擦拭取樣口，打開取樣閥，先排放 2-3mL 管路內的殘留液體（避免管路污染樣品），再用無菌離心管收集樣品（體積 5-10mL），取樣后關閉取樣閥，并用無菌生理鹽水沖洗取樣管。

• 樣品分析：及時檢測樣品的關鍵指標，判斷發酵進程：

• 微生物生長：測定菌體量（如 OD600 吸光度、干重法）、活菌數（平板計數法）；

• 營養消耗：檢測殘糖（如 DNS 法、高效液相色譜）、氨基氮（如茚三酮法）；

• 產物合成：根據產物類型檢測（如抗生素用抑菌圈法、酶用活性測定、有機酸用滴定法）。

• 調整策略：若分析發現參數異常（如殘糖過低、菌體量增長緩慢），需及時調整工藝（如增加補料量、提高通氣量），避免發酵失敗。

三、操作后：發酵終止與設備清洗（核心目標 —— 避免殘留污染）

1. 發酵終止與產物收集

• 終止操作：關閉攪拌、無菌空氣供應，若需快速降溫，可加大冷卻水流速；對于需滅活的發酵液，可通入蒸汽（100℃，10 分鐘）或加入滅活劑（如甲醛，按需使用）。

• 產物收集：打開放料閥，將發酵液轉入后續處理設備（如離心分離機、過濾機、提取罐），收集菌體（如酵母、益生菌）或上清液（如酶、抗生素）；放料后關閉放料閥，避免殘留液體滋生雜菌。

2. 設備清洗與維護

• 初步清洗：向罐內加入純化水（或稀堿溶液，如 0.5% NaOH，去除蛋白質殘留），開啟攪拌（200-300rpm），清洗 10-15 分鐘，然后通過放料管排出清洗液；重復 2-3 次，直至清洗液澄清，無培養基殘留。

• 探頭與管路清洗：拆卸 pH 電極、DO 電極，用純化水沖洗后浸泡在保護液中（如 pH 電極浸泡在 3mol/L KCl 溶液，DO 電極浸泡在飽和亞硫酸鈉溶液）；用純化水沖洗取樣管、補料管、進氣 / 排氣管路，確保無殘留。

• 干燥與檢查：清洗后打開罐蓋和所有閥門，通入壓縮空氣（或無菌空氣）吹干罐內和管路，避免潮濕環境滋生霉菌；檢查密封件、探頭、閥門是否完好，若有損壞及時更換；記錄本次發酵的所有參數（如溫度、pH、產物濃度），歸檔保存。

• 長期存放：若長期不使用，需在罐內涂抹少量無菌凡士林（保護罐壁），關閉所有閥門，套上防塵罩，定期檢查設備狀態。

發酵罐操作流程的五個步驟