小鼠細胞實驗培養步驟

      小鼠細胞常用的分離方法有兩種，一種是貼塊法，一種是消化法，這兩種方法都可以用于分離和培養原代細胞。

一、實驗分離和培養步驟

1. 小鼠頸椎脫臼處死后，剃除腹胸部的被毛，放入裝有75%酒精的燒杯中浸泡5min。

2. 取出小鼠，在無菌環境下打開胸腔，取出心臟組織，注入盛有無菌1×PBS的培養皿中，洗凈組織表面的血液。

3. 將清洗干凈的心臟組織轉入裝有75%酒精的培養皿中浸泡15s以殺死大多數的心臟被膜細胞，浸泡完成后立即轉入裝有無菌1×PBS的培養皿中震蕩清洗。

4. 清洗完成后，用剪刀鑷子配合除去主動脈弓和心房組織，僅保留心室部分，再次用1×PBS清洗去除心室內的血液。

5. 將清洗干凈的心室組織用剪刀減成1mm3大小左右的碎塊，之后用PBS清洗若干次后按下述兩種方法之一進行后續操作。

A. 貼塊法

6. 將清洗好的碎塊轉入另一培養皿中，用0.25%胰蛋白酶消化液浸泡組織，室溫消化3-5 min。

7. 消化完成后，添加數毫升FBS終止消化，之后吸棄液體，加PBS清洗組織塊1伺次后，用200 ul吸頭將組織塊平均接種于T-25培養瓶的培養面上，之后將培養瓶放置于37℃二氧化碳培養箱中，靜置2-4h。

8. 待組織處于略微脫水的狀態時，小心添加2ml培養基，添加時注意盡量不要將組織塊沖起，要使培養基接觸所有的組織塊。

9. 之后放入培養箱中繼續培養，一般2-4天后成纖維細胞會從組織塊周圍爬出，待爬出的細胞有較多數量時，可將細胞消化下來，去除組織塊，轉入另一培養瓶中培養。

B. 消化法

6. 將清洗好的碎塊轉入另一離心管中，加入混合消化液（0.08%胰酶+0.06%Ⅱ型膠原酶）37℃水浴消化8 min后，吸取上層混懸液棄去。

7. 余下組織加入混合消化液10 ml，37℃水浴震蕩消化10 min；吸取上層懸液至另一離心管中，加入適量FBS終止反應；剩余沉淀物再加消化液消化3-5次，直至組織塊消化。

8. 按1∶1加入含血清的培養基，中止酶反應，懸液過200目網篩去除較大的組織塊。

9. 收集全部中止后的消化液于離心管中，300g，離心10 min，棄去上清，加入培養液重懸細胞后計活細胞數。

10. 調整細胞密度以1× 106個/ml 接種入的T-25培養瓶中，每瓶添加2 ml細胞懸液。

11. 培養瓶放置于37℃，5% 二氧化碳培養箱中靜置40min后，吸棄上清液以去除未貼壁的非成纖維細胞和死細胞，再添加5 ml培養基繼續培養。

二、傳代步驟

如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補加培養基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。

4. 將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

三 、復蘇步驟

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養基，培養過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。

四 、凍存步驟

待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例：

1. 細胞凍存時，棄去培養基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入2ml培養基終止消化，可使用血球計數板計數。 

2. 1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數量分配到凍存管中，注意凍存管做好標識。本公司按每個凍存管細胞數目大于1X10^6個細胞凍存。

3. 將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。